中國科學技術大學(中校區)生命科學學院結構



  PCR、酶切、連接、轉化

簡介(INTRODUCTION

完整的分子克隆可以簡述為“分→切→接→轉→篩→表”六個實驗,如下圖:

PCR、酶切、連接、轉化是傳統基因克隆方法獲得重組質粒必不可少的步驟。用PCR方法擴增要克隆的目的基因,限制性內切酶酶切使插入片段和克隆載體之間建立互補配對的堿基序列,再經連接酶的連接反應完成插入片段和線性載體之間的重組??紤]到重組效率問題,通常要先將連接的產物轉化到用于擴增質粒的克隆大腸桿菌感受態細胞種,進一步篩選正確的重組子。

PCR:即多聚酶鏈式反應。它是一種用于放大擴增特定的DNA片段的分子生物學技術,它可看作是生物體外的特殊DNA復制,PCR的最大特點,是能將微量的DNA大幅增加,因此也常用于基因克隆時獲取大量的目的基因。

PCR擴增原理:

酶切: 限制性內切酶能特異性地結合于一段被稱為限制性酶識別序列的DNA序列之內或其附近的特異性位點上,并切割雙鏈DNA。分子克隆實驗中最常用的是Ⅱ 型酶,且是那些識別4個或6個堿基對的限制性內切酶。Ⅱ 型限制性內切酶的識別順序是一個回文對稱順序。切割后得到的是帶粘性末端或平末端的線性DNA。 連接: DNA連接酶催化雙鏈DNA分子中相鄰堿基的5’-P末端與3’-OH間形成3’,5’-磷酸二酯鍵。一個DNA片段的5’-P末端與另一個3’-OH末端相靠時互近,在DNA連接酶的作用下,有Mg2+, ATP存在的緩沖系統中可以被連接起來而形成重組分子。常用的DNA連接酶是T4 DNA連接酶,其作用底物是雙鏈的DNA分子或RNA:DNA雜交分子,可以連接粘性末端、平末端。

酶切-連接原理圖:

重組DNA的轉化: 體外連接的DNA分子必須盡快引入寄主細胞,否則會很快降解,而且只有導入到細胞中后,才能擴增及研究其功能的表達,細胞轉化是常用也是最有效的方法之一,細菌轉化是指裸露的(或純化的)DNA被細菌吸收而導致基因轉移的現象。凡是能吸收游離的DNA片段的細菌,稱為感受態細菌,或者說處于感受態。大腸桿菌的感受態需誘導。

將對數生長期的細菌放入0℃的CaCl2低滲溶液中,細胞膨脹,形成原生質球,誘導感受態;DNA加入后,形成抗DNase的羥基-磷酸鈣復合物,粘附于原生質球表面,42℃熱沖擊,DNA被吸收,將細胞混合物涂布于合適的(篩選)培養基培養幾小時,細胞得以恢復和增值,轉化基因得以表達,然后根據合適的選擇條件可以區分轉化細胞和非轉化細胞。

材料(MATERIALS

o  試劑(REAGENTS)

o  PCR試劑:核酸模板、引物、dNTPs (dATP、dTTP、 dGTP 、dCTP) Mix、MgCl2、DNA聚合酶、PCR buffer(HF、GC)

o  酶切試劑:限制性核酸酶切酶、酶切buffer

o  連接試劑:T4 DNA連接酶、10×T4 DNA連接酶buffer或2×T4 DNA連接酶buffer

o  轉化試劑:感受態細胞(如DH5α、TOP10)、抗性LB平板、無菌無抗的SOC或LB培養基

o  試劑準備(REAGENT SETP)

ü  PCR部分:準備10X Primers(10μM):用蒸水或TE buffer 稀釋,詳見實驗步驟中的備注部分。

ü  酶切部分:正確選取所用限制酶的高效反應buffer、反應溫度,如果用水浴鍋,要提前將水浴鍋調到相應的恒定溫度。保證酶切后的載體背景在一個較低的水平。

ü   連接部分:選擇合適的插入片段與載體比例。

ü   轉化部分:選取正確的感受態細胞:克隆用感受態細胞,并盡量選取高效率的感受態細胞(如效率在107左右)。

o  器械(EUIPMENT)

ü   PCR儀、離心機、37℃  恒溫培養箱、恒溫水浴鍋、搖床、超凈工作臺、酒精燈、涂布棒、水平式電泳裝置、電泳儀、微量移液槍、微波爐、紫外透射儀

實驗步驟(PROCEDURE

PCR部分  à預期時間消耗:5小時

1.      建立PCR反應體系(以Pfu DNA聚合酶為例)

Pfu DNA聚合酶的PCR擴增體系

總體積

試劑

 

20μL

 

50μL

 

100μL

 

ddH2O

 

13μL

 

26μL

 

51μL

 

5X HF/GC Buffer

 

4μL

 

10μL

 

20μL

 

10 X dNTP (2.5mM each

 

2μL

 

5μL

 

10μL

 

50mM MgCl2

 

0-0.2μL

 

0.5μL

 

1-5μL

 

Pfusion polymerase

 

0.2μL

 

0.2-0.5μL

 

1-2μL

 

Primers

 

2μL+2μL

 

5μL+5μL

 

10μL+10μL

 

DNA template

 

0.1-1μL

 

0.1-1μL

 

0.2-2μL

 

DMSO*(一般不

 

0.2μL

 

0.5μL

 

1μL

 

 

選擇薄壁的PCR管,按照上述體積系數,將上述物質依次加入混勻。

如果建立的體積較大,可將同一種PCR反應先建立大體積的Mix,然后再分裝到PCR管。

▲關鍵步驟:

①       酶催化反應通常最后加入酶,并冰上操作;

②       要控制好反應體系中核酸模板的量,含量太高可能會導致實驗失??;




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