昆蟲細胞表達系統



桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統 1 蛋白表達系統概述

原核表達系統主要有大腸桿菌表達系統和枯草芽孢桿菌表達系統。1983年有兩個課題組在大腸桿菌中表達了真核生物的基因 (Harris et al. 1983;Wetzel and Goeddel 1983)。因大腸桿菌在其遺傳、生物化學與分子生物學方面已經被了解得比較透徹,所以它是許多外源蛋白表達的首選系統。大腸桿菌表達系統最大的特點是培養費用低、耐受能力強,并且能夠高效地表達外源蛋白,其缺點是不能進行表達后修飾??莶菅挎邨U菌表達系統的優點是目的蛋白能以可溶的活性形式高產量地分泌到培養基中,但在蛋白表達過程中枯草芽孢桿菌會分泌一些蛋白酶降解目的蛋白,并且這個系統的表達量往往低于大腸桿菌表達系統。

目前常用的真核表達系統中有:哺乳動物細胞表達系統、酵母表達系統和桿狀病毒表達系統(也稱為昆蟲細胞表達系統)。哺乳動物表達系統有許多優點:(1)表達的蛋白能進行翻譯后修飾并正確的折疊;(2)能組成性或誘導性地表達目的蛋白;(3)目的蛋白還能以轉基因形式表達(Colosimo et al. 2000)。但是,哺乳動物表達系統表達速度較慢,花費較高,并不適合用于蛋白大規模生產。酵母表達系統主要使用的是釀酒酵母和畢赤酵母。酵母表達系統的優勢主要有兩個方面,一方面是酵母中能進行蛋白表達后修飾,且它比哺乳動物表達系統成本低。另一方面是它表達的目的蛋白先在酵母細胞內,然后通過酵母的分泌系統,分泌到培養基中,得到折疊及修飾后的蛋白(Byrne et al. 2005)。但是,酵母細胞中蛋白的糖基化與哺乳動物中天然蛋白質的糖基化不同。因此,當目的蛋白的糖基化是保持蛋白活性的關鍵時,不應該選擇酵母表達系統(Higgins et al. 1998)。酵母表達系統另一個缺點是大多的重組蛋白在這個系統中表達效率較低。相對于另外幾個系統,桿狀病毒/昆蟲細胞(BEVS, Baculovirus expression vector system)是一個比較折中的蛋白表達體系(下圖):

昆蟲細胞表達系統

幾種表達系統的對比

桿狀病毒作為外源基因表達載體的優勢主要有以下幾個方面:

(1)易于操作。桿狀病毒基因組較小,分子生物學特性比較簡單,并且基因組上有多種限制性內切酶酶切位點。

(2)容納的外源基因大。桿狀病毒的病毒粒子是桿狀的,容納外源基因可塑性比較強,理論上它能容納任何外源基因。

(3)能高效表達外源基因。在桿狀病毒基因中p10基因和多角體蛋白基因都是極晚期基因,它們的啟動子能夠高效表達目的蛋白。

(4)能對目的蛋白進行表達后修飾。桿狀病毒的宿主為昆蟲細胞,目的蛋白可以利用昆蟲細胞的翻譯后修飾系統進行加工和修飾。

(5)安全性高。桿狀病毒表達載體特異性非常強,只能夠在昆蟲細胞中進行復制。

(6)成本低。與哺乳動物細胞比較,昆蟲培養細胞系相對更易于生長,并且昆蟲細胞能懸浮培養可大量生產目的蛋白。

但是,桿狀病毒表達載體也存在一些缺點。桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統是一個瞬時表達系統。并且桿狀病毒表達載體的啟動子為晚期啟動子表達時限是從感染后22-24小時開始至宿主細胞死亡,蛋白高水平表達時間很短。昆蟲細胞一般不提供復雜的N-糖基化。雖然這種類型的N-糖基化通常足以提供有生物活性的蛋白產物,但是末端缺乏復雜糖基化有可能影響蛋白的溶解性和穩定性。另外,桿狀病毒高水平表達蛋白的同時會致使細胞翻譯后修飾的速度跟不上表達的速度,可能會降低產生表達后修飾蛋白。目前,桿狀病毒-昆蟲細胞表達系統已經廣泛應用于人類健康、醫學、農業等領域。

2 桿狀病毒表達載體的研究進展

AcMNPV遺傳圖譜初步確定后,科學家們開始探索AcMNPV基因組的功能。1980 Summers等把多角體基因定位到了AcMNPV圖譜上,之后Vlak等(1981)準確地定義了多角體基因的位置。隨后,Rohrmann課題組(1982)確定了多角體基因的轉錄方向及編碼氨基末端的區域。同年,Smith和Esche報道了AcMNPV基因組轉錄圖譜。Smith把6個早期和13個晚期多肽確認并映射到了AcMNPV基因組上,并且把多角體蛋白基因更準確的定位到圖譜上。1983年,Roche和Smith把極晚期基因p10定位到圖譜上。在這些基礎上,Smith等人定向突變多角體蛋白基因并且在多角體基因啟動子下插入了外源基因,這同時也證明了多角體蛋白是非必須基因。

1983年,Smith首次在AcMNPV多角體啟動子下成功克隆并表達了人的β-干擾素。同一時間,Hooft等報道了多角體基因的核苷酸序列。并且Pennock印證了產生重組病毒的方法,并通過分選出的重組病毒表達多角體蛋白-β-半乳糖苷酶的融合蛋白。隨后,桿狀病毒表達載體系統(baculovirus expression vector system,BEVS)開始在昆蟲中表達目的蛋白。隨著對桿狀病毒上啟動子的研究越來越透徹,發現桿狀病毒啟動子能夠單獨或與多角體蛋白啟動子聯合表達單個或多個外源蛋白。這個發現也為后來桿狀病毒表達載體的發展提供了很重要的基礎。在這個過程中研究者們定位了AcMNPV高效表達基因p10并測得其序列,之后構建了用p10啟動子表達外源蛋白的AcMNPV。1988年Vlak等證明p10是非必須基因,并且在p10的位點上用p10啟動子表達了β-半乳糖苷酶的融合蛋白。




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