生命科學研究熱點,基因突變的檢測方法



PCR-SSCP 法是在非這性聚丙烯酰胺凝膠上,短的單鏈DNA 和RNA 分子依其大街基序列不同而形成不同構象,一個堿基的改變將影響其構象而導致其在凝膠上的移動速度改變。其基本原理為單鏈DNA 在中性條件下會形成二級結構,這種二級結構依賴于其堿基組成,即使一個堿基的不同,也會形成不同的二級結構而出刺同的遷移率。由于該法簡單快速,因而被廣泛用于未知基因突變的檢測。

用PCR-SSCP 法檢測小于200bp 的PCR 產物時,突變檢出率可達70%-95%,片段大于400bp 時,檢出率僅為50%左右,該法可能會存在1%的假陽性率。應用PCR-SSCP 法應注意電泳的最佳條件,一般突變類型對檢測的靈敏度無大的影響,同時該法不能測定突變的準確位點,還需通過序列分析來確定。Sarkar 等認為對于大于200bp 的片段,用其RNA 分子來做SSCP 會提高其錄敏度。

應用PCR-SSCP 檢測點突變已見報道于人類大部分的腫瘤組織或細胞,如乳腺癌、食管癌、肺癌、胃癌、肝癌、胰腺癌等。檢測的基因包括多種癌基因及抑癌基因,也是檢測抑癌基因p53 突變最常用的方法,僅檢測第5-8 外顯子即可發現85%以上的p53 基因突變。由于該法簡便快速,特別適合大樣本基因突變研究的篩選工作。

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異源雙鏈分析法(HA)

HA 法直接在變性凝膠上分離雜交的突變型一野生型DNA 雙鏈。由于突變和野生型DNA 形成的異源雜合雙鏈DNA 在其錯配處會形成一突起,在非變性凝膠中電泳時,會產生與相應的同源雙DNA 不同的遷移率。該法與SSCP 相似,所不同的是SSCP 分離的是單鏈DNA,HA 法分離的是雙鏈DNA,也只適合于小片段的分析。但HA 對一些不能用SSCP 檢出的突變有互補作用,兩者結合使用,可使突變檢出率提高到近100%。

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突變體富集PCR 法

突變體富集PCR (mutant-enriched PCR),本法的基本原理是利用ras 基因家族某個密碼子部位存在已知的限制性內切酶位點,如K-ras 基因第12 密碼子的BstNI 位點,第13 密古巴子有BgⅠⅡ位點。用鏈續二次的巢式 PCR 來擴增包括K-ras 第12、13 密碼子的DNA 片段,在兩次擴增反應之間用相應的內切酶消化擴增的DNA 片段,野生型因被酶切而不能進入第二次PCR 擴增,而突變型則能完整進入第二次PCR 擴增并得到產物的富集。

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變性梯度凝膠電泳法

變性梯度凝膠電泳法(denaturing gradinent electrophoresis,DGGE),DGGE 法分析PCR 產物,如果突變發生在最先解鏈的DNA 區域,檢出率可達100%,檢測片段可達1kb,最適圍為100bp-500bp?;驹砘诋旊p鏈DNA 在變性梯度凝膠中進行到與DNA 變性濕度一致的凝膠位置時,DNA 發生部分解鏈,電泳適移率下降,當解鏈的DNA 鏈中有一個堿基改變時,會在不同的時間發生解鏈,因影響電泳速度變化的程度而被分離。

由于本法是利用溫度和梯度凝膠遷移率來檢測,需要一套專用的電泳裝置,合成的PCR 引物最好在5`末端加一段40bp-50bp 的GC 夾,以利于檢測發生于高熔點區的突變。在DGGE 的基礎上,又發展了用濕度梯度代替化學變性劑的TGGE 法(溫度梯度凝膠電泳temperature gradient gelelectrophoresis,TGGE)。DGGE 和 TGGE 均有商品化的電泳裝置,該法一經建立,操作也較簡便,適合于大樣本的檢測篩選。

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化學切割錯配法

化學切割錯配法(chemical cleavage of mismatch,CCM),CCM 為在Maxam-Gilbert 測序法的基礎上發展的一項檢測突變的技術,其檢測突變的準確性可與DNA 測序相仿。其基本原理為將待測含DNA 片段與相應的野生型DNA 片段或DNA 和RNA 片段混俁變性雜交,在異源雜合的雙鏈核酸分子中,錯配的C 能被羥胺或哌啶切割,錯配的T 能被四氧化餓切割,經變性凝膠電泳即可確定是否存在突變。

該法檢出率很高,也是檢片段最長的方法,已有報功檢測了1.7kb 片段,如果同時對正、反義鏈進行分析,檢出率可達100%。應用熒光檢測系統可增強敏感度,可檢測到10 個細胞中的1 個突變細胞。該法中的化學試劑有毒,又發展了碳二亞胺檢測法(catodiimide,CDI),CDI 為無毒物質,也可檢測大片段DNA 的點突變。

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等位基因特異性寡核苷酸分析法

等位基因特異性寡核苷酸分析法(allele-specific oligonucleotide,ASO),ASO 為一種以雜交為基礎對已知突變的檢測技術。以PCR 和ASO 相結合,設計一段20bp 左右的寡核苷酸片段,其中包含了發生突變的部位,以此為探針,與固定在膜上的經PCR 拉增的樣品DNA 雜交??梢杂酶鞣N突變類型的寡核苷酸探針,同時以野生型探針為對照,如出現陽性雜交帶,則表運河樣品中存在與該ASO 探針相應的點突變,ASO 需嚴格控制雜交條件和設置標準對照避免假陽性和假陰性。目前已有商品化的檢測盒檢測部分癌基因ASO 突變。

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DNA 芯片技術




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