【科研動態】口蹄疫滅活疫苗的破乳檢測方法



口蹄疫病毒(FMDV)作為一種小核糖核酸病毒,基本是由4種結構蛋白(VP1、VP2、VP3和VP4)和7種非結構蛋白組成,呈二十面體,其二十面體衣殼包含著60份的結構蛋白vp1- vp4。一份的VP1、VP2、VP3和VP4組合形成一個原粒,5個原粒通過頂點的相接聚合形成一個五聚體,12個五聚體相互作用包裹了病毒基因而形成一個完整的FMDV粒子。完整病毒顆粒的離心沉降系數為146S。大量數據表面,用完整的病毒顆粒(即146S抗原)可制備出高效的疫苗。在國內,口蹄疫滅活疫苗的制備是將病毒滅活再與相應佐劑相混合而制成雙相乳劑疫苗(水/油/水)。

油乳劑疫苗一般包括含有抗原介質的水、表面活性劑和油三種成份。其中,表面活性劑會存在一個HLB(Hydrophilic-Lipophilic Balance)親水親油平衡值,通過一般計算可用來預測表面活性劑的特性。公式如下:HLB=20;當值在3-8表明油包水乳化劑;值在8-15表明水包油乳化劑;值在15-20表明增溶劑。一般情況下,乳液是熱力學不穩定的,乳化過程就是建立穩定的分散狀態,它會自然嘗試回到更穩定的狀態與分相狀態。佐劑旨在提供動力學穩定的乳液,反乳化會發生,但很長的時間后才會發生,因為表面活性劑穩定化油相和水相之間的界面。在它的保存時間過程中疫苗是穩定的。乳劑破乳是在疫苗的制備中、存儲中和疫苗接種中的不期望效果,但有時需要破乳以取回水相并分析它。溶劑的使用改變系統的HLB,有助于改變界面張力,并破壞該油相/水相界面的穩定性,選擇合適的破乳劑對破乳效果至關重要。

【科研動態】口蹄疫滅活疫苗的破乳檢測方法

如何高效快速的檢測口蹄疫疫苗質量一直是人們關注的焦點,動物實驗作為檢驗口蹄疫疫苗質量的有效方法,長期以來被廣泛應用,然而因其操作要求復雜,試驗周期過長,給檢驗工作帶來了很大的困難。對此有研究者發明了一種破乳檢測的方法,在實驗室檢測技術中得到了廣泛的使用。此方法操作簡單、快速,基本上不會破壞口蹄疫病毒粒子146S的完整性,且回收效率高,穩定性好。這給口蹄疫疫苗質量監測帶來了極大的便利。此種方法也被疫苗生產企業和國家質量檢測部門廣泛使用。

材料

待檢口蹄疫O型、A型滅活疫苗,由本公司提供。破乳有機溶劑(苯甲醇、正戊醇、氯仿、正己醇),購自上海麥克林生化科技有限公司。生物安全柜,超速冷凍離心機,分液漏斗,移液器,連續流紫外分光光度計,玻璃容器等。其它試劑有15%-45%蔗糖梯度,PBS等。

方法

2.1

試劑配置

PBS 緩沖液(1L):8g NaCl,0.2g KCl,3.628g Na2HPO4?12H2O,0.24g KH2PO4,定溶于1L去離子水中,高壓滅菌備用。

15%-45%蔗糖梯度:0.04mol/L磷酸鹽、0.15mol/L NaCl,pH7.6- 8.0 的PBS緩沖液制備15%- 45%均勻線性蔗糖梯度。

2.2

操作方法

2.2.1 146S 抗原分離

在潔凈的生物安全柜中,將有機破乳劑與待檢口蹄疫油乳劑滅活疫苗按1∶0.06–0.2的體積比充分混勻1分鐘以上;然后將分液漏斗至于試管架上,在 4°C冰箱中靜置30分鐘以上,最終使得油、水分層,此時在分離出的水相層中會含有146S 抗原。然后采用密度梯度離心法對破乳后所得水相層中的146S抗原進行檢測。

2.2.2 146S 抗原液濃縮

在事先遇冷的超速離心中高速離心含146S抗原的液體,離心完用1/10原體積的PBS溶液進行重懸,得到146S抗原的濃縮液,置于4°C冰箱中備用 。

2.2.3 蔗糖密度梯度超速離心

配置15% - 45%均勻線性蔗糖梯度,將濃縮的抗原液及空白對照加置其頂部,然后在超速離心機中35000rpm、10°C下離心3h。

2.2.4 連續流紫外分光光度計定量檢測

離心結束后,棄去梯度頂部1- 2ml的液體,緩慢的將連接在連續流紫外分光光度計流動樣品池上進樣端的長針頭插入待檢樣品的管底,啟動連續流紫外分光光度計的操作程序,連續不間斷的測定各個級份的 OD259nm 值。

2.2.5 計算146S抗原含量

通過檢測會得到被檢樣品的OD值峰面積 PA,再根據公式 X0= 計算出所檢抗原液中146S抗原的含量 X0(μg/ml)(PL=0.5cm,是連續流紫外分光光度計比色皿的光程長度;E=76,是校正系數;W=10ml,是樣品的原始體積;FR=1ml/min,為蔗糖通過樣品池的流速;FSD=0.5,為吸光度;S=1cm/min,為速度)。然后,再根據公式 X=X0/1.35 ,進一步可計算出所檢抗原液中146S抗原含量的校正值X ;最后依據公式Y= -1.0343X2+2.244X-0.0082,計算出疫苗中的146S抗原含量Y ,與已知疫苗樣品在配制時 146S 抗原的加入量對比獲得二者一致性的高低。

結果




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