基于氮氧自由基的自旋標記是最受歡迎和最成熟



與電子順磁共振(EPR)光譜結合使用的定點自旋標記(SDSL)已經成為一種經過驗證的可靠技術,用于闡明蛋白質和蛋白質復合物的結構,功能和動力學?;诘踝杂苫淖孕龢擞浭亲钍軞g迎和最成熟的標記之一,因為它們小,無干擾并且表現出優異的光譜性質。“理想的自旋標記程序具有很高的反應速率和選擇性,”康斯坦茨大學化學系復雜系統光譜學教授Malte Drescher教授和該研究的主要作者,以及專門研究有機合成的Valentin Wittmann教授解釋道。

基于氮氧自由基的自旋標記是最受歡迎和最成熟

“同時實現高反應性和高選擇性可能是一個問題,”Drescher繼續說道。“例如,基于釓(III)或三苯甲基的常規自旋標記顯示非常寬的光譜和低調制深度或非常窄的光譜,不適合我們想要進行的各種實驗。” 由Drescher,Wittmann及其康斯坦茨大學化學家團隊發表的一項新研究,于2019年8月14日在線發表在ChemBioChem Communications雜志上,介紹了一種標記蛋白質的新方法,該蛋白質具有基于氮氧自由基的自旋標記和基因編碼的非經典氨基酸酸(ncAAs)作為SDSL的靶標。

“氮氧化物提供理想的光譜寬度和獲取動態信息的能力,”康斯坦茨化學生物學研究院(KoRS-CB)的博士研究員,該研究的第一作者Anandi Kugele說道,他獲得了國家高中著名的旅行補助金。磁場實驗室將在美國科羅拉多州丹佛舉行的2019年Rocky Mountain磁共振會議上公布結果。“傳統的基于氮氧化物的標簽具有有限的氧化還原穩定性,這是細胞內應用的一個缺點。我們面臨的挑戰是增加氮氧化物的穩定性,從而適應基于氮氧自由基的旋轉標簽,用于未來的常規體內使用。” 為此,研究人員開發了一種新的自旋標記,可以通過逆電子需求Diels-Alder(DAinv)環加成對遺傳編碼的ncAAs附著到蛋白質上,這種方法已被證明適用于廣泛的體外和體內應用。 。為了實現氮氧化物的穩定性,研究人員進一步采用了基于光可移動保護基團的保護策略,已知保護基團可保護氮氧化物并根據需要釋放它們。

新的自旋標記 - 用于DAinv反應的光活化氮氧化物,或簡稱PaNDA - 在體外和裂解物測試中都具有水溶性,EPR活性和去保護效率,兩種模型蛋白綠色熒光蛋白(GFP)和大腸桿菌氧化還原酶硫氧還蛋白(TRX),幾乎在所有已知的生物體中都有發現。“我們確實需要改進用于向細胞遞送PaNDA自旋標記的方法,并測試細胞內的標記和去保護效率,”Malte Drescher總結道:“但我們的研究清楚地表明,原則上, PaNDA 標簽可用于在具有挑戰性的生物環境中進行EPR測量,包括細胞內部。我們在大腸桿菌裂解液中的測試在這方面非常有前景。這將通過EPR光譜學開辟一系列新的蛋白質研究機會。“

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