酷!Cas9 不切DNA就可以編輯堿基失活基因



酷!Cas9 不切DNA就可以編輯堿基失活基因

生物極客導讀:

對于高拷貝的基因組而言,如果一旦用CRISPR進行切割,極有可能引發復雜的基因組重組等副反應。來自弗吉尼亞醫學院的科學家們近期在Nature Methods發表文章,使用cas9偶聯上堿基突變的BE3結構域,通過改變單個核苷酸來敲除基因以產生終止密碼子,結果表明,這種被稱為“CRISPR-STOP”方法是一種有效的、較不有害的替代野生型cas9的基因敲除研究。不僅如此,他們在早期在約7000個人類基因中引入終止密碼子。 CRISPR-STOP介導的靶向篩選示與WT cas9相當的功能,表明相應的方法對全基因組功能篩選的適用性。

酷!Cas9 不切DNA就可以編輯堿基失活基因

文章解讀:

CRISPR技術的效率和簡單性在基因敲除(KO和功能基因組研究中呈現前所未有的功能。在目標位點,Cas9產生雙鏈DNA斷裂,進而由非同源末端連接(NHEJ)同源性重組(HDR)機制修復。由于插入和缺失(indels)經常引起移碼突變,NHEJ修復機制通常實現基因KO,因此可以實現相應基因功能研究。盡管NHEJ介導的基因沉默非常有效,但最近的研究已經提出了關于使用野生型(WT)Cas9方法進行雙鏈DNA斷裂影響的擔憂。首先,系統引入無法控制的隨機indel,并不是所有的indel都會導致基因KO,有些甚至可能為目標蛋白引入新的功能。其次,更重要的是,WT Cas9的雙鏈DNA切割已顯示導致過度的DNA損傷和細胞死亡,特別是在多拷貝基因組區域。這可能會混淆實驗結論,因為致死性和降解型表型將與靶基因功能無關。在一項具有里程碑意義的研究中,Komor等人最近證實,APOBEC1酶和尿嘧啶糖基化酶抑制劑與切口酶Cas9(BE3)的融合有效地將胞嘧啶(C)轉化成尿嘧啶(U或T) sgRNA的非結合鏈不引起雙鏈DNA斷裂或需要外源DNA模板。

展開全文

在這里,科學家們利用這個CRISPR-BE 來改變遺傳密碼并引入早期的密碼子。將BE3靶向包含CGA(Arg),CAG(Gln)和CAA(Gln)的基因的編碼鏈,以分別產生TGA,TAG或TAA終止密碼子。類似地,通過將最后兩個Gs中的任何G改變為A(或非編碼序列中的C至T),編碼鏈中的靶向TGG(Trp)產生TGA,TAG和TAA終止密碼子(圖1a)。為了測試方法的效率,我們在mCherry蛋白的前半部分確定了四個潛在的誘導型停止(i-stop)密碼子。我們將靶向這些密碼子的sgRNA與BE3基礎編輯者或WT Cas9一起短暫轉染到mCherry陽性HEK293T細胞中。為了測量KO效率,使用流式細胞術定量mCherry陰性細胞(mCherry KO)。在用BE3轉染的細胞中,在四種sgRNA(sgRNA2,sgRNA3和sgRNA4)中有三種,觀察到明顯更多的mCherry陰性細胞。這些結果表明,BE3介導的無義突變是報告基因的有效基因沉默方法,盡管BE3蛋白復合物相對于WT Cas9的蛋白表達和/或轉染效率略低。值得注意的是,導致BE3(> 35%的細胞)的最高數量的KOMP3和sgRNA4都以產生終止密碼子的兩個潛在Gs(目標鏈中的Cs)靶向Trp密碼子。

為了證實觀察到的KO效應是由于APOBEC1在BE3復合物中的密碼子編輯催化活性,科學家們在APOBEC1的催化結構域中引入了先前鑒定的8個失活突變(P29F和E181Q)。如預期的那樣,具有突變型APOBEC1的BE3復合物不產生mCherry陰性細胞。此外,與WT Cas9不同,引導BE3與sgRNAs產生同義突變(基本編輯而不改變密碼子)不會導致mCherry表達的丟失。目標DNA測序結果證實了在九個單細胞中的四個(g)引物序列的第四和第八個核苷酸之間的復合物的R環中的特異性C至T轉變。替換率符合mCherry流式細胞術結果。最近的研究已經證明,當靶向高拷貝數基因組區域時,WT Cas9可能導致過度的DNA損傷和隨后的細胞死亡或適應性降低。為了測試WT Cas9在含有高拷貝mCherry基因的細胞中可能是有害的假說,并且這可能是一個似乎合理的原因,為什么當用WT Cas9靶向,我們觀察到少的mCherry陰性胞,我們產生了含有可單細胞克隆mCherry基因的數量。我在低(2n)和高拷數(> 12mCherry陽性胞克隆中測試了相同的四種sgRNA。在兩種胞系中,BE3WT Cas9更有效地工作。




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